QIAGEN Pyrosequencing平台

 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。佰真研究院拥有QIAGEN公司最新的PyroMark Q24焦磷酸测序仪（图2-37），采用成熟的焦磷酸测序技术，是集测序、样品制备、试剂和对照以及完整和灵活的软件于一体的系统。PyroMark Q24非常适用于二、三和四等位基因突变以及连续CpG位点分析及定量，相比于Sanger测序需在测序前进行耗时的PCR产物克隆，独特的PyroMark Q24在数分钟内即可提供1-24个样品的序列分析及高度准确的定量结果。

图2-37. PyroMark Q24焦磷酸测序仪

1. 检测原理

基因组DNA首先经过亚硫酸氢盐处理，序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶保持不变。亚硫酸氢盐转化完成后，根据研究目的的不同可以选择不同的DNA 甲基化检测方法，明确是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化，或是要发现全基因组中新的甲基化位点，根据客观条件筛选最灵敏、可靠、经济、简便的方法进行分析。

Pyrosequencing技术（图2-38）通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。该技术通过将链合成过程中释放出的焦磷酸（PPi（转化成光信号来监测链的合成过程。测序引物可与PCR扩增的单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶等酶以及底物，包括腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素一起孵育。与模板链互补的dNTP在DNA聚合酶的催化下结合到DNA链上，每次互补结合都会释放与dNTP摩尔量相当的焦磷酸（PPi）。存在APS的条件下ATP硫酸化酶将PPi转化为ATP，ATP可驱动荧光素酶介导的荧光素氧化，发出与ATP量成正比的可见光。荧光素酶催化反应产生的可见光可用电荷耦合器检测，可在原始数据输出中看到一个峰值（Pyrogram）。每个峰的高度（光信号）与结合的核苷酸量成正比。三磷酸腺苷双磷酸酶是一种核苷酸降解酶，可连续降解未结合的核苷酸与ATP。降解完成之后，结合另一个核苷酸。dNTP是依次添加的，反应时Alfa-硫代三磷酸脱氧腺苷（dATPS）是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。当反应继续时，形成互补的DNA链，核苷酸序列由Pyrogram的信号峰值确定。

2. 技术特点

(1) 流水线式流程：多功能PyroMark Q24可与表观遗传学和基因分析流程无缝结合，且与QIAGEN先进的样本制备、亚硫酸氢盐转化和PCR扩增技术相兼容；流水线式的流程意味着可更快速地获得结果。

(2) 快速简便：从PCR产物到单链样品直接用于测序，应用PyroMark Q24真空底座可在15分钟内同时制备24个样品，使用该工作站操作简单，且手动时间少于5分钟。

(3) 自动化分析：PyroMark Q24软件包含两种分析模式：CpG和 AQ（等位基因定量分析）。这两种模式可在同一个板上分析，支持同时分析不同类型的样品。AQ模式可用于分析单个和多元位点以及二、三和四等位基因突变；CpG模式可用于分析多重连续CpG位点，提供亚硫酸氢盐处理的内参。

3. 应用领域

(1) SNP分型

(2) 等位基因频率分析

(3) 甲基化检测 

(4) 细菌和病毒分型

4. 参考文献

(1) Goudie DR, et al. Multiple self-healing squamous epithelioma is caused by a disease-specific spectrum of mutations in TGFBR1. Nat Genet. 2011;43:365-369.

(2) Shen J, et al. Genome-wide DNA methylation profiles in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2012. [Epub ahead of print]

(3) Lu J, et al. Use of Pyromark Q96 ID pyrosequencing system in identifying bacterial pathogen directly with urine specimens for diagnosis of urinary tract infections. J Microbiol Methods. 2011;86(1):78-81.

(4) Xie H, et al. High-throughput sequence-based epigenomic analysis of Alu repeats in human cerebellum. Nucleic Acids Res. 2009;37(13):4331-40.

(5) Mereau A, et al. Analysis of splicing patterns by pyrosequencing.Nucleic Acids Res. 2009;37(19):e126.

(6) Guda, K., et al., Infrequent detection of germline allele-specifcexpression of TGFBR1 in lymphoblasts and tissues of colon cancer patients. Cancer Res. 2009;69(12):4959-61.