Illumina二代测序平台
Illumina公司是全球领先的新一代生命科学工具的开发和生产者，该公司推出的新一代测序技术平台，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）的研究。佰臻研究院拥有Illumina Hiseq 2000测序系统，以及2011年2月最新推出的MiSeq个人测序系统，提供各类快速、经济、高效的遗传分析，应用广泛。
（一） Hiseq 2000测序系统（图2-10）
图2-10. IlluminaHiseq 2000测序系统
1.检测原理
该测序系统的大体工作流程包括文库的构建（Library Preparation）、DNA簇的生成（Clu-ster Generation）、测序反应（Sequencing）以及数据分析（Data Analysis）四步(图2-11)。
全自动的Illumina簇生成工作站c-Bot（图2-12）能在四小时内完成测序文库的克隆扩增，手工操作时间仅为10分钟。其基本反应原理是通过桥式PCR来扩增模板片段，在桥式PCR反应中，正向引物和反向引物都被通过一个柔性接头（flexible linker）固定在固相载体（solidsub-strate）上，经过PCR反应，所有的模板扩增产物就都被固定到了芯片上固定的位置。c-Bot与传统的桥式PCR的不同之处在于，其交替使用Bst聚合酶进行延伸反应以及使用甲酰胺（form-amide）进行变性反应。经桥式PCR扩增之后，成千上万的复制产物制备出来，会在固相载体上形成一个个的模板“克隆”。每个“克隆”簇都分别固定在芯片表面一个单一的物理位置上。一块芯片的8条独立“泳道”上每一条泳道上都可以独立产生数百万这样的簇，这样一次就可以同时对8个不同的文库进行测序。
Illumina专利的簇生成过程就简单性和操作时间而言，优于乳液PCR等方法，而c-Bot又进一步简化了流程，让测序操作更高效。
Illumina测序系统的核心思想是边合成边测序（sequencing by synthesis）。该系统在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，利用专利的“可逆性末端终结反应”进行测序反应。四种不同的dNTP分别用不同颜色的荧光标记，且每个碱基末端被保护基团封闭。在每一轮测序循环中，标记不同荧光基团的四种核苷酸以及DNA聚合酶同时加入流通池通道中，按照碱基互补配对的原则进行DNA 链的延伸，且单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行。如此反复，得出碱基的精确序列（图2-13）。该测序技术可以生成高密度、海量平行测序反应，可对每个流动槽中成百上千万的模板进行单端或对读测序。
图2-11. Hiseq 2000测序基本工作流程
图2-12. Illumina c-Bot 簇生成系统
图2-13. Illumina系统基本测序原理
2.技术特点
(1) 快速，高通量：HiSeq 2000使用两个流动槽和一种新颖的双表面成像方法，能够在单次运行中产生200 Gb的数据，每天能产生25 Gb，使测序通量及实验灵活性提升到新的水平（Table 2）。
(2) 操作简便，省时：HiSeq 2000具有最简化和直观的操作流程，预先配置的即插即用试剂，足够200个循环使用，启动运行仅需10分钟的手工操作时间。触摸屏界面，以及实时的远程运行监控，让仪器操作更简单。文库制备时96个样品的平行处理显著降低了手工操作时间和整体的费用。
(3) 费用低廉，灵活应用：对人类基因组进行测序，覆盖度可达到30倍。与GAII系列分析系统相比，每个基因组的测序费用下降一半以上。HiSeq 2000能在单个或两个流动槽模式下操作，独立操控的流动槽让需要不同读长的应用能同时运行，达到了实验灵活性和仪器可扩展性的较好结合。
3.应用领域
(1) DNA测序
(2) 基因调控分析
(3) 转录组分析
(4) SNP发现与结构变异分析
(5) 细胞遗传学分析
(6) ChIP-Seq
(7) 测序法甲基化分析
(8) 小RNA的发现及分析
（二）Miseq个人测序系统（图2-14）
图2-14. Miseq个人测序系统
1.基本原理
MiSeq测序反应基本原理同Hiseq 2000，它使用TruSeq试剂盒并结合创新的动力系统，可在几小时内获得研究结果。对于目前的新一代测序用户，可利用MiSeq系统以一小部分的时间和费用完成较小的项目，是目前唯一结合了扩增、测序和数据分析在一台仪器的新一代测序仪，体积小巧，采用末端配对流体系统和完整的数据分析。MiSeq有着革命性的流程和无可比拟的准确性，这让它成为快速且经济高效的遗传分析的理想平台，适合广泛的应用。
2.技术特点
(1) 革命性的测序流程：仅需50ng起始DNA。直观的触摸屏解密，带有RFID（Radio Frequency IDentification）追踪的即插即用的试剂。一台测序仪即整合了簇生成、SBS测序和完整的数据分析，而不再需要配置辅助性硬件。
(2) 简短的试验周期：MiSeq是新一代测序系统中周转时间最快的一台，能在几个小时而不是几天内获得结果。制备文库的时间仅为2小时。随后是1小时的克隆扩增和最快3小时的测序。在内置的仪器计算机上开展完整的数据分析。质量打分、序列拼接、序列比对、检查变异，不到2小时即可完成。
(3) 久经考验的新一代测序试剂：MiSeq系统特有全新的流体系统结构，能使试剂循环时间缩短5倍。以Illumina久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止子方法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长的DNA链时检测它们。由TruSeq技术推动的Illumina测序带来了最高的数据完整性，以及最高产量的无偏差读取和最多的>Q30碱基检出。（Table 3）
3.应用领域
(1) 扩增子测序
(2) 克隆检查
(3) 小基因组测序
(4) 高度多重的PCR扩增子测序
(5) 定向重测序
(6) ChIP-Seq
(7) miRNA测序
4.参考文献
(1) Najmabadi H, et al. Deep sequencing reveals 50 novel genes for recessive cognitive disorders. Nature. 2011;478: 57-63.
(2) Amores A, et al. Genome Evolution and Meiotic Maps by Massively Parallel DNA Sequencing: Spotted Gar, an Outgroup for the Teleost Genome Duplication. Genetics. 2011; 188(4): 799–808.
(3) Shinzato C, et al. Using the Acroporadigitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature. 2011;476:320–23.
(4) Wu G, et al. Statistical Quantification of Methylation Levels by Next-Generation Sequencing. PLoS One. 2011; 6(6): e21034.
(5) Al-Balool HH, et al. Post-transcriptional exon shuffling events in humans can be evolutionarily conserved and abundant. Genome Res. 2011;21: 1788-99.
(6) Li R, et al. The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature. 2010; 463:311-7.
(7) Hittinger CT, et al. Remarkably ancient balanced polymorphisms in a multi-locus gene network. Nature. 2010;464:54-8.
(8) Harris SR,et al. Evolution of MRSA during hospital transmission and inter-continental spread. Science.2010;327:469-74.
(9) Ponts N, et al. Nucleosome landscape and control of transcription in the human malaria parasite. Genome Res. 2010;20:228-38.
(10) Hansen RS, et al. Sequencing newly replicated DNA reveals widespread plasticity in human replication timing. ProcNatlAcad Sci. 2010; 107:139-44.
(11) Gu H, et al. Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution. Nat Methods. 2010; 7:133-6.